Desde su aparición en el mercado, en los años 50, ha habido una laguna en cuanto a los métodos de análisis de quelatos, dado que son moléculas complejas, y que, como ya hemos comentado, pueden sintetizarse en compañía de una elevada cantidad de subproductos que dificultan el análisis. En la actualidad y gracias a las nuevas técnicas de separación y análisis, sobretodo las cromatográficas se dispone de métodos fiables que pueden utilizarse para cuantificar los quelatos.
Puesto que la molécula de quelato presenta dos componentes, el hierro y el agente, y dado que la legislación exige información sobre ambos componentes, existen, métodos que tratan de cuantificar el Fe y sus fracciones y otros que tratan de cuantificar el quelato propiamente dicho.
Destacamos aquí la determinación de hierro soluble, que implica la disolución y determinación por espectroscopía de AA o ICP de la fracción soluble de Fe de la muestra de quelato. Este método es oficial dentro de la CE.
Otro método propuesto por el CEN para su aprobación en la CE es el que proporciona el total de elemento complejado. Su aplicación es principalmente para mezclas de micronutrientes. Este método consiste en cuantificar el hierro (y otros micronutrientes) que permanece en disolución después de hacer interaccionar la muestra de quelato disuelta con una resina catiónica, de modo que únicamente la fracción de Fe complejada, con carga negativa o neutra sería determinada. Este método no distingue la forma química del complejo, por lo que
cualquier complejante (citrato, NTA, EDTA, o,p-EDDHA, etc) contribuiría al resultado final del análisis. Además, dado las características químicas del hierro es imposible que exista Fe en disolución que no esté acomplejado a los pH típicos de los fertilizantes, por lo que los resultados obtenidos por el método de Fe soluble y por el de las resinas deben ser prácticamente coincidentes. En un ensayo interlaboratorio obtuvimos en nuestro laboratorio los resultados mostrados en la figura 5 para 15 muestras de EDDHA, que declaraban tener un 6% de Fe soluble. Se aprecia claramente el resultado concordante de ambos métodos.
Para la determinación del Fe-quelado de los quelatos férricos se han propuesto dos tipos de métodos: los colorimétricos, claramente en desuso por la gran cantidad de intereferentes existentes, y los cromatográficos utilizados actualmente, mediante los cuales se separan el quelato férrico de otros componentes presentes en la formulación y se cuantifica de forma aislada la cantidad de quelato.
Se han empleado muy diversas técnicas cromatográficas como son: cromatografía en papel (Hill-Cottingham, 1962), cromatografía en capa fina, cromatografía en columna de vidrio preparativa (Boxema, 1979) y cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) (Barak y Chen, 1987; Deacon y col., 1994; Lucena y col., 1996; Hernández-Apaolaza y col., 1997).
En colaboración con la Universidad de Wisconsin, hemos desarrollado han desarrollado un método de cromatografía de par-iónico mediante HPLC para la identificación y determinación Fe(III)-EDTA, Fe(III)-DTPA, Fe(III)-EDDHA y Fe(III)-EDDHMA (Lucena y col.,1996). Se trata de un método isocrático que utiliza como fase
estacionaria una columna C-18 y como fase móvil una disolución acuosa de 30% de acetonitrilo y 0,03 M de TBOH a pH = 6,0 y que se ha mostrado aplicable a formulaciones comerciales (Hernández-Apaolaza y col., 1997). Con este método, la separación y la identificación de los picos correspondientes a los diferentes quelatos férricos, son obtenidas con una buena resolución y selectividad, incluyendo la separación de los diastereoisómeros de los productos que los presentan, y todo ello en un tiempo de análisis inferior a 15 minutos, lo cual supone una notable mejora con respecto a los métodos previamente descritos. Hernández-Apaolaza (1997) aplica este método a varias formulaciones comerciales de Fe(III)-EDDHSA obteniendo los picos correspondientes a los dos diastereoisómeros a tiempos de retención muy altos con respecto al resto de los quelatos férricos analizados con ese mismo método.
Otro médodo alternativo es el estudiado por el CEN para su propuesta como método oficial de análisis de quelatos en el ámbito Europeo. Este método, modificado a partir del de Barak y Chen, 1987, limitado a productos no formulados en mezclas, se basa en la cromatografía iónica. Como columna se utiliza una resina aniónica empaquetada en una precolumna utilizando como eluyente una disolución ácida de sulfato. Con este método no se separan los diastereoisómeros, y la resolución y selectividad es inferior a la del método de Lucena y col, 1996. De hecho en la cuantificación de los productos EDDHMA incluye otros isómeros posicionales del metilo, producidos en la síntesis.
En el ensayo interlaboratorio anteriormente mencionado se analizaron igualmente las muestras por ambos métodos cromatográficos. En la figura 6 se presentan los obtenidos por nuestro laboratorio para 15 productos Fe-EDDHA y en la figura 7 para 10 productos Fe-EDDHMA. Ambos métodos proporcionan resultados similares para los quelatos Fe-EDDHA, con la desventaja para el método CEN de que no proporciona los datos sobre subproductos ni la distribución de los isómeros geométricos. Para los quelatos Fe-EDDHMA las diferencias son mayores, y esto se debe a que el método de Lucena et al, 1996, distingue el quelato Fe-EDDHMA de otros isómeros posicionales del metilo (indicados como "otro EDDHMA" en la figura). De hecho si sumamos estos otros quelatos al determinado como Fe-EDDHMA los resultados son más coincidentes. El método del CEN tampoco es capaz de distinguir productos como el FeEDDH5MA (grupo metilo en posición 5) que es el agente quelante de los productos 1 y 5 en vez del Fe-EDDHMA. Un dato que se aprecia claramente es que en ninguno de los productos analizados se alcanza el 6% indicado en la composición, y sólo un producto con Fe-EDDHA y otro con Fe-EDDHMA rondan el 80% de este 6% (4.8%) permitido por la legislación.
La cuantificación de los quelatos férricos, además de métodos adecuados requiere de la disponibilidad de patrones. Si bien hasta hace poco se podía obtener EDDHA de elevada pureza como reactivo, en la actualidad no hay ningún distribuidor que lo comercialice. Para que un patrón pueda ser utilizado se requiere que se conozca su pureza establecida por RMN, y corroborada por HPLC, así como su capacidad complejante, que puede ser obtenida por valoración fotométrica con un patrón de hierro. Los patrones utilizados en nuestro laboratorio, aparte del EDDHA obtenido hace años de la fuente comercial, han sido preparados por nuestros colaboradores del Departamento de Química Orgánica I de la UCM y comprobados por las técnicas anteriormente descritas. La falta de obtención aún de un patrón de EDDHSA ni de EDDCHA hace que su cuantificación exacta no sea posible. Además, en estos productos se aprecia la existencia de quelatos de distintas estequiometrías que no son cuantificados adecuadamente por las técnicas de HPLC descritas.
